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腸道固有層免疫細胞分離制備指南

更新時間:2025-02-13      點擊次數:210

1、實驗前準備

 

試劑準備

 

40% Percoll溶液配制:

Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合,配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比4:6混合,配制40%等滲Percoll溶液。

 

80% Percoll溶液:

Percoll細胞分離液與PBS緩沖液(10×)按體積比9:1混合,配制等滲100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按體積比8:2混合,配制80%等滲Percoll溶液。

 

2、腸道固有層免疫細胞分離步驟操作步驟

 

1)頸椎脫臼法處死小鼠并固定在手術臺上,75%酒精消毒小鼠腹部,于正中縱行剪開暴露腹腔;

2)如下圖所示,在小鼠胃與十二指腸連接處剪斷,一邊分離小腸周圍脂肪組織和腸系膜,一邊拉出小腸,之后在小腸和盲腸連接處剪斷,從而分離出小腸。

 

小鼠腸道組織解剖圖

 

3)10cm培養皿中加入5mL 4°C預冷的PBS,將步驟2中的小腸放入培養皿潤洗,使用鑷子和剪刀依次去除脂肪組織和派伊爾結。

 

小鼠派伊爾結去除操作圖

 

A. 去除表面脂肪和腸系膜等組織的小腸,紅色箭頭指示派氏結(平均每只小鼠有6-9個派氏結);

B. 剪去派氏結的操作示意圖;

C. 去除派氏結后的小腸,紅框是所有剪下來的所有派氏結。

小鼠派伊爾結(Peyer's patches, PPs)是小鼠腸道黏膜免疫系統的重要組成部分,主要分布在小鼠小腸的下部,即遠端空腸和回腸,與小鼠固有層免疫細胞的組成和功能有顯著差異,在分離小鼠腸道免疫細胞時,去除派伊爾結是為了確保獲得更純凈、更具代表性的目標細胞群體,從而提高實驗結果的可靠性。

 

4)將小腸切成4段,用剪刀縱向剪開小腸(不必沿著腸系膜方向),暴露出腸內容物,輕輕地將腸內容物從粘膜表面刮除;

5)將小腸轉移到含有10mL HBSS + 2%FBS的50mL離心管中,劇烈渦旋10-20s;

6)用鑷子取出小腸重復清洗2次;

7)將清洗過的腸組織,剪碎成0.5cm的小片段,將組織塊(100-200mg)轉移到2mL圓底管中,加入1mL小鼠腸道組織解離液(abs50093),37°C水平搖床輕輕搖晃孵育60min(根據組織糜爛狀態適當延長孵育時間);

8)從水平搖床中取出圓底管,劇烈渦旋10-20s,通過70μm細胞篩網(abs7232)過濾,用10mL PBS沖洗細胞篩網;

9)收集含有細胞的濾液到50mL管中,20°C下400g離心5min,棄上清液,用 4 mL 40% percoll(abs9102)重懸細胞沉淀并轉移到 15 mL 離心管;

10)吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 離心管底部,試管稍微傾斜,將 4 mL 40% percoll 與細胞的混合液沿著管壁緩慢加入離心管,覆蓋在 80% percoll 溶液的頂部形成密度梯度;

▲ 注意:不要破壞 80% percoll 和 40% percoll 與細胞的懸浮液的分界面,40% 和 80% percoll 現配現用。

11)800 g 20 °C 離心 20 min,升速(ACC)1,降速(DEC)1;

 

Percoll 分離組織免疫細胞示意圖

 

注:分離圖片參考自文獻 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327

 

12)離心結束后,吸取中間白膜層免疫細胞至新的 15 mL 離心管中,加入 3 倍體積 4°C 預冷 PBS,上下顛倒混勻,4 °C 下 400 g 離心 5 min,棄上清;

13)按照步驟 12 重復清洗一次,棄上清得到腸道固有層淋巴細胞;

14)細胞染色緩沖液(abs9475)重懸細胞沉淀,并調整細胞濃度至 5-10×106 cells/mL,將 100 μL/管的細胞懸液分配到 12×75 mm 的流式管(abs7303)中用于后續實驗操作。

 

3、流式實驗結果圖

 

 

4、相關產品推薦


貨號

品名

規格

用途

abs9474

組織保存液

100mL

保存組織

abs50093

小鼠腸道組織解離試劑盒

25T

消化組織酶

abs9102

細胞分離液

100mL

富集細胞

abs7232

70um 細胞篩網

100 個

篩網

abs7303

5mL 流式管(無菌無酶,帶帽)

500 個

流式管

abs9475

細胞染色緩沖液

500mL

染色緩沖液




 

更多流式好物推薦


貨號

產品名稱

規格

abs9907

流式絕對計數管

50T

abs9477

小鼠 Fc 受體阻斷劑

200T/500T

abs9476

人 Fc 受體阻斷劑

50T/200T

abs9488

鞘液

20L

abs9107

佛波酯

1mg/5mg/25mg

abs9108

離子霉素鈣鹽

1mg/5mg

abs970

D-PBS緩沖液(1×,無鈣鎂)

500mL

abs810012

Brefeldin A

10mg/25mg/50mg

abs812975

Monensin sodium salt

25mg/100mg

abs9110

固定劑

50mL

abs9111

破膜劑

150mL

abs7303

5mL流式管(無菌無酶,帶蓋)

1箱

abs1840002

APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9)

25T/100T

abs182427

PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4)

25T/100T

abs182430

FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4)

25T/100T

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PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96)

25T/100T

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FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4)

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