背景介紹

過量飲酒會導致肝臟氧化應激、脂肪堆積和炎癥。隨著酒精性肝病 (ALD) 在全球的流行，ALD的研究迅速增加。目前，許多研究試圖發現有效治療ALD的藥物，包括使用抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡和調節腸道微生物群的藥物。

甘油三脂檢測在ALD研究中的應用

肝脂積聚是酒精性肝病的主要病理特征之一。先前的研究表明，二甲雙胍通過抑制硬脂酰輔酶A脫飽和酶1 (SCD1) 或miR-33b的表達來抑制高糖和高胰島素誘導的肝細胞TG蓄積。還有研究表明，二甲雙胍可以通過激活AMPK信號通路逆轉脂肪肝。然而，其在ALD中的作用尚不清楚。

Xie等^[1]采用一系列檢測手段探究了二甲雙胍調節酒精性肝病脂代謝的可能機制。其中甘油三酯 (TG) 檢測試劑盒(abs580085)用于檢測細胞內TG的濃度，以確定二甲雙胍對ALD的影響。

甘油三酯檢測試劑盒使用方法介紹

檢測原理：

甘油三酯 (TG) ，也稱為三酰甘油三酯或三酰甘油酯，是植物油和動物脂肪中的主要成分。在人體內，血液中甘油三酯的高水平與動脈粥樣硬化、心臟病和胰腺炎有關。試劑盒檢測原理是利用脂肪酶對甘油三酯進行水解，產生甘油和游離脂肪酸。隨后通過偶聯酶促反應在500nm下比色讀數，測定釋放甘油的量，再換算成甘油三酯的含量。

備注：

1、Enzyme：使用前加入9mL Diluent溶解；
2、Dye Reagent：使用前加入10mL Diluent溶解；
3、Assay Buffer（未提供）：例如制備100mL緩沖液，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。

操作步驟：

1、試劑和材料

1）自備試劑：Assay Buffer（例如制備100mL緩沖液，請將35mL庚烷和65mL異丙醇混合在一起。）
2）自備材料：酶標儀、蒸餾水、移液器與槍頭、離心機、計時器等。

2、樣品處理

1）細胞/細菌樣品：細胞/細菌（5×10⁶個）離心后棄上清，加入1mL緩沖液，超聲處理（功率20%，超聲處理3s，間隔10s，重復30次）后，4℃、10000g離心10min，取上清轉移至新離心管中，置于冰上待檢測；
2）組織樣品：稱取0.1g組織，加入1mL緩沖液，冰上勻漿后，4℃、10000g離心10min，將上清液轉移至新的離心管中，置于冰上待檢測；

3）血清/血漿樣品：直接置于冰上待檢測。

3、標準曲線制備

用蒸餾水對試劑盒提供的標準品（5mmol/L）進行2倍連續稀釋，形成標準曲線。

4、樣品預實驗

對于未知的樣品，濃度可能在很大的范圍內變化。建議多做幾個稀釋梯度進行預實驗，以確保讀數在標準曲線范圍內。

5、樣品檢測

按照以下方式加樣完成后，蓋上板膠帶，混合均勻。將96孔板放入37℃的烘箱中反應10min，隨后用酶標儀在500nm下檢測吸光值。

6、樣品濃度計算

樣品濃度計算試劑盒說明書中提供兩種計算方式：標準曲線法、公式法。

針對說明書既有計算公式又有標曲的試劑盒，兩種方式任選一種就可以，公式是簡便算法。建議按照標曲計算，雖然比較麻煩且耗費試劑，但檢測結果會更加準確。按照標曲計算，每一次都需要重新做標曲，因為這種反應是一個變化的過程，檢測的數值會隨著反應時間、溫度等產生變化。

圖 甘油三酯檢測標準曲線示例（檢測限：0.1mmol/L-5mmol/L）

常見問題解答

Q1：我想要檢測肝臟細胞在處理后，合成甘油三酯的能力是否改變，我的理解是一方面要檢測細胞內的甘油三酯，另一方面也要檢測細胞分泌到培養液中的甘油三酯，那么我是不是應該把我處理后的細胞沉淀收取，培養上清也一并保留，這么理解對嗎？

A1：理論上是的，既然既要檢測細胞內的又要檢測分泌出來的，那肯定是要一并保留上清和細胞的。

Q2：如果是將細胞上清收集后檢測，那么按照細胞培養上清樣品的檢測方法，我的培養上清稀釋倍數是需要通過預實驗來確定嗎？

A2：稀釋倍數都是要通過預實驗來確定的。

Q3：Enzyme和Dye Reagent都是粉末狀，需要溶解，其中Dye Reagent說明書提示建議現用現配，那我如果想要做預實驗的話，這兩種試劑溶解后，都能夠放在-80℃保存嗎？

A3：這樣操作是對的，特別是酶，溶解后在-80 ℃保存最好。需要注意的是染料不管是低溫還是高溫都會氧化，建議老師預實驗做完盡早開展實驗，一次性多測些樣品，防止試劑溶解后長期儲存影響檢測效果。

Q4：TG試劑盒里面的檢測板可以拆分嗎？因為如果要做預實驗摸索稀釋倍數的話，可能只做幾個孔。

A4：板子不能拆分，但是可以用常規的96孔酶標板替代做預實驗。

Q5：該試劑盒可以檢測組織樣本，對組織樣本的保存有什么要求嗎？

A5：沒有什么特殊要求，新鮮或者液氮速凍的組織都可以。

[1] Xie F , Zhong Y , Wang D ,et al. Metformin protects against ethanol-induced liver triglyceride accumulation by the LKB1/AMPK/ACC pathway[J].Molecular biology reports, 2022,49(8):7837-7848.

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