圖 1.人膽管類器官在 A 公司的基質膠和 OrganoGel 基質膠中的生長情況。人膽管類器官由細胞核染料 DAPI（藍色），緊密 連接蛋白抗體 anti-ZO1 和細胞骨架蛋白 F-actin 的染料 Alexa Fluor 647 Phalloidin 染色成像。

圖2. 人原發腸癌類器官在A公司的基質膠和OrganoGel基質膠中的生長情況。

圖3. 肝癌類器官在A公司的基質膠和OrganoGel基質膠中的生長情況。肝癌類器官由細胞核染料DAPI（藍色），肝臟細胞生物標志物HNF4a和肝癌標志物GPC3的抗體染色成像。

圖4. 人臍靜脈內皮細胞 HUVEC 在 A 公司的基質膠和 OrganoGel 基質膠上均可形成血管網絡。HUVEC細胞由活細胞染料Calcein AM染色（綠色）成像。

一、 類器官培養（操作所需時間為 1 小時）

1. 將基質膠于 4°C 冰箱里的冰上過夜解凍。

2. 將 24 孔板放置于培養箱預熱。

3. 用預冷的槍頭將解凍的基質膠進行分裝。

4. 準備病人或者動物組織（或者類器官）來源的，細胞總數為 1X105的單細胞懸液。300g 離心 5min。

5. 取 50µL 的 OrganoGel 基質膠與離心所得的細胞進行混勻。

6. 取出預熱的 24 孔板，立即將基質膠與細胞的混合物滴加在孔板里，立即將 24 孔板放入培養箱。

7. 約 10min 后，基質膠凝固后，向孔板里加入 500µL 類器官培養基，放于培養箱進行培養。

二、腫瘤類器官藥敏實驗（操作所需時間為 2 小時）

1. 將擴增好足夠量的腫瘤類器官（實驗組）以及正常類器官（對照組）用 4°C 預冷的基礎培養基進行重懸，緩慢機械吹打，促進膠液化溶解，并保持類器官結構完整（可用于懸浮培養于有 5%基質膠溶液的基質膠表面）（Guillen et al. 2022）。或者通過 TryplE 酶消化獲得單細胞懸液。

2. 離心收集類器官細胞，并進行細胞計數。

3. 加入 OrganoGel 基質膠原液，與細胞進行混勻。

4. 將細胞與膠的混合物，通過排槍加入 37°C 預熱過的 96 孔板，或者 384 孔板，立即將孔板放入培養箱。

5. 大約 10min 后，OrganoGel 基質膠將凝固，加入相應體積的類器官培養液進行培養。

6. 類器官形成后（如果是機械吹打，類器官將在傳代 24h 后就會形成；如果是酶消化，類器官會在 3-5 天 后形成），每個孔分別加入含有 PI 染料以及不同種類、不同濃度的待篩選的抗腫瘤藥物。

7. 用高內涵顯微鏡上進行活細胞成像，測定腫瘤類器官對各種藥物的敏感性。

三、免疫缺陷小鼠成瘤實驗（操作所需時間為 1 小時）

1. 搜集用于注射小鼠的細胞 1X105個，以 1:1 的體積與 OrganoGel 基質膠混合，為方便注射，建議每次注射總體積不低于 100µL。

2. 用脫毛器對小鼠注射部位皮膚進行脫毛，然后用酒精棉球進行消毒。

3. 用不帶針頭的 1mL 注射器將細胞和膠的混合物吸入針頭，再裝上 16g 的針頭（針頭內直徑為 1.194mm）， 將混合物注射到皮下，或者大腿肌肉（針對代謝特別旺盛的腫瘤細胞）。

四、血管生成實驗（以永生化 HUVEC 細胞系為例，操作所需時間為 1 小時）

1. 將*培養基換成饑餓細胞用培養基：加入含 0.2% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM 丙酮酸鈉，100U/ml 青 霉素和 100µg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養基培養 24 小時。

2. 將 OrganoGel 基質膠均勻鋪滿 96 孔板底。注意：槍頭需提前預冷半小時。盡量在冰上操作，避免基質膠過早固化，避免氣泡產生。

3. 將 96 孔板在細胞培養箱孵育 30min，固化基質膠。

4. 消化 HUVEC 細胞，并計數。

5. 將 200µL 的 HUVEC 細胞懸液（含 5X104個細胞）加于含基質膠的 96 孔板中。將 96 孔板放于培養箱。

6. 血管樣網絡結構將于 3 至 12 小時間形成。

7. 在血管網絡形成最佳時間，小心去除培養基，并用加入含活細胞染料 1/1000 Calcein AM（綠色）的培養 基進行染色，并用顯微鏡進行拍照記錄。

五、神經軸突 3D 生長實驗（以大鼠胚胎神經干細胞為例，操作所需時間為 2 小時）

1. 取孕期 12-15 天的大鼠胚胎，用眼科剪和眼科鑷分離出大腦皮層于 4°C 預冷的 DMEM 培養基中。

2. 用吸管輕緩吹打，然后用 70µm 濾網過來，獲得單細胞懸液，并進行細胞計數。

3. 離心（300g，3min），棄上清。將細胞與 OrganoGel 基質膠進行混合，然后將基質膠混合物滴加在 24 孔 板中，每孔 50µl。

4. 將 24 孔板放于培養箱，大約 10min 后，OrganoGel 基質膠將凝固。加入 1mL 神經元分化培養基：Neurobasal medium，2% B27, 2mM L-glutamine，5%FBS，20ng/mL EGF 和 20ng/mLbFGF，100U/mL penicillin 和 100 µg/mL streptomycin。第二天開始，就能觀察到有明顯的神經軸突生長。

5. 在第 7 天可觀察到大量的神經突（Neurite）長出。