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Western Blot進階技巧首彈——從了解目的蛋白開始

更新時間:2020-05-26      點擊次數:4158

蛋白質印跡 (Western Blot),相信大家對此都不陌生,做為檢測蛋白表達及半定量的基礎實驗方法,也是很多小伙伴們初入實驗室的入門課。

“上手容易,精通難”可謂對WB實驗的注釋,初入實驗室的“菜鳥”可以很快上手,做出漂亮的條帶,做過多年的“大神”也可能一著不慎,實驗“翻車”,結果一塌糊涂。有些實驗室甚至流傳著一些所謂的“玄學”,新手人品好,難做的條帶給新手做等等。

真的是這樣么?實驗技術可不是拼人品,靠運氣的事兒,接下來小編將會為大家帶來WB進階技巧系列,干貨滿滿,讓大家提升WB實驗技巧,成為真正的實驗“大神”。


首先,讓我們了解一下什么是WB實驗吧:

▲《定義》WB又稱為免疫印跡 (immune blot) ,是根據抗原抗體的特異性結合半定量的檢測樣品中的某種蛋白的方法。

▲《原理》通過凝膠電泳,將不同分子量大小的蛋白質分離開,再利用特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

▲《應用》定性檢測:目標蛋白有無,分子量大小;定量檢測:檢測目標蛋白含量(半定量)

圖1. WB操作流程圖
 

看到這,相信之前對WB了解不多的同學也應該對WB有了一個基礎的認識。那么,怎樣可以把這看似簡單的幾步做好,拿到漂亮的實驗結果呢?話不多說,上干貨。

小編首先要強調的一點,就是了解目的蛋白,這也是今天這篇文章主要給大家分享的內容。可能有的小伙伴會有疑問,為什么要講一個跟WB操作沒關系的步驟呢?說好的WB進階呢?其實,這往往是很多新手忽視的關鍵點,對目的蛋白一知半解,是沒有辦法做好WB實驗的,其他免疫學實驗也是一樣,可能有的小伙伴還不是特別相信,接下來讓小編帶大家看看為什么了解目的蛋白是如此的重要吧~


了解目的蛋白對整個WB實驗的重要性:


1. 了解目的蛋白,才知道目的蛋白在實驗樣品中是否有表達

WB實驗檢測,很多小伙伴會遇到的問題之一就是無條帶,也就是陰性結果,如何判斷陰性結果是實驗操作問題造成的“假陰性”還是本該如此的“真陰性”,這就需要大家在實驗前,就對目的蛋白有一個清晰的認識。很多蛋白的表達是有組織特異性的,例如IL-10R,在視網膜,脾臟和肺腺癌組織中有高表達,其他組織表達含量較低;還有一些蛋白,則需要特定的刺激條件才會高表達,這種情況往往在磷酸化蛋白及炎癥因子蛋白等中較為常見,如果未做特殊的處理,目的蛋白表達含量很低,無法被WB檢測出。


2.了解目的蛋白,才知道如何制備樣本

樣本制備也是WB的關鍵步驟,后續的文章中也會為大家詳細分析。如何選擇合適的樣本制備方法,關鍵因素就是要了解目的蛋白;除了上面一步中的要了解目的蛋白表達組織,及預處理條件外,還需確認目的蛋白表達的亞細胞定位,例如,細胞膜蛋白,核蛋白,線粒體蛋白和胞漿蛋白的提取方式都不一樣,選擇合適的方式,才能制備合格的樣品,方便后續的WB實驗。另外一個需要注意的因素就是需要加入對應的蛋白酶抑制劑,這一點對于磷酸化的蛋白尤為重要,否則蛋白在提取過程中就被降解,會造成“假陰性”結果。


圖2. 裂解液選擇參考表

3. 了解目的蛋白,才知道如何選擇內參

內參抗體,是WB實驗中的重要參考,WB可以對目的蛋白進行半定量分析,判斷不同樣品中目的蛋白表達含量的多少,就是取決于內參的標定。內參選擇在WB實驗中是很關鍵的因素,可不是GAPDH或者β-actin萬用的哦。內參如何選擇,重要的決定因素就是目的蛋白,尤其是目的蛋白的表達位置及預處理條件。小編在這里總結了一下內參的選擇表,大家可以保存哦~

圖3. 內參選擇參考表
 

好了,相信大家應該知道實驗前了解目的蛋白的重要性了吧,如何了解目的蛋白呢?可以通過UniProt網站搜尋蛋白的相關信息,也可以在Pubmed上查閱對應的研究文獻,相信聰明的小伙伴們肯定可以做好的,今天的分享就先到這,接下來我們還會分享整個WB操作過程中的細節,全面提升大家的WB水平,歡迎關注!


 

蛋白質印跡(Western Blot)實驗中產品推薦:

實驗步驟  推薦指數  貨號  產品名稱  規格
樣本制備   abs9228  RIPA (中)  100ml
   abs9229  RIPA (強)  100ml
   abs9230  RIPA (弱)  100ml
   abs9231  RIPA (強,無抑制劑)  100ml
   abs9160  NP-40  100ml
   abs9195  1M Tris-HCl,pH6.8  1L
   abs9201  1M Tris-HCl,pH8.8(更多pH請看absin網站)  1L
   abs9117  SDS  100ml
  ★★  abs9116  WB/IP 細胞裂解液  100ml
  ★★  abs9239  WB/IP 細胞裂解液(無抑制劑)  100ml
  ★★★★  abs9101  紅細胞裂解液  100ml,250ml,500ml
   abs812852  PMSF  50mg,100mg,200mg
   abs816442  Aprotinin 抑肽酶 10mg,25mg,50mg,100mg
   abs817902  Peptatin 胃蛋白酶抑制劑A 10mg,25mg,50mg,100mg
   abs9133  EDTA  100ml
   abs42017684  EGTA  1g,10g
   abs817431  原釩酸鹽  100mg,500mg
   abs47014865  β-甘油磷酸鹽  10g,25g
  ★★  abs9161  廣譜型蛋白酶抑制劑混合物  1ml
  ★★  abs9162  廣譜型磷酸酶抑制劑混合物  1ml
蛋白定量  ★★  abs9232  BCA蛋白定量試劑盒  500次,2500次
  ★★  abs9233  增強型BCA 蛋白定量試劑盒  500次
上樣與電泳   abs9226  DTT溶液(1mol/L)  5ml,10ml
   abs9237  2X Laemmli樣品緩沖液  5ml*2
   abs9238  10%SDS十二烷基硫酸鈉溶液  500ml
  ★★  abs953  2*上樣緩沖液 (適用于SDS-PAGE)  10ml
  ★★  abs9301  預制膠 10%,10 wells  5片/盒
  ★★  abs9308  預制膠 10%,15 wells  5片/盒
  ★★  abs9302  預制膠 12%,10 wells  5片/盒
  ★★  abs9309  預制膠 12%,15 wells  5片/盒
   abs9303  預制膠 15% ,10 wells  5片/盒
   abs9310  預制膠 15% ,15 wells  5片/盒
   abs9304  預制膠 4-15%, 10 wells  5片/盒
   abs9311  預制膠 4-15%, 15 wells  5片/盒
  ★★  abs9305  預制膠 4-20%, 10 wells  5片/盒
  ★★  abs9312  預制膠 4-20%, 15 wells  5片/盒
   abs9307  預制膠 8%, 15 wells  5片/盒
   abs9306  預制膠 8-20%, 10 wells  5片/盒
   abs9313  預制膠 8-20%, 15 wells  5片/盒
  NEW  abs9328  3-5kd小分子量預制膠,16.5%,10wells  10片/盒
  NEW  abs9329  3-5kd小分子量預制膠,16.5%,15wells  10片/盒
  ★★★  abs925  蛋白電泳套裝  
   abs951  running buffer  100ml,1L
  ★★★★★  abs923  預染蛋白marker, 10-245 KDa  500ul,5*500ul
  ★★★★★  abs924  預染蛋白marker, 10-180 kDa  250ul,2*250ul
   abs966  Genshare考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液  500ml
  ★★★  abs964  考馬斯亮藍染色試劑盒(常規型)R250  1kit
   abs965  考馬斯亮藍染色試劑盒(增強型)G250  1kit
轉膜   abs931  PVDF膜0.2 μm  20張
  ★★  abs932  PVDF膜0.45 μm  20張
  ★★  abs959  NC膜0.2 μm  20張
   abs960  NC膜0.45 μm  20張
   abs950  10*電轉液  100ml,1L
封閉   abs9174  脫脂奶粉  100g,500g
  ★★★★★  abs9155  BSA  50g,100g
一抗孵育  ★★  abs830031  Beta actin antibody   50ul,100ul
   abs132001  Beta actin antibody   50ug,100ug
   abs119680  Beta Actin Polyclonal Antibody  50ul,100ul
   abs132184  Beta-Actin antibody  50ug,100ug
   abs137975  Beta-Actin Mouse Monoclonal Antibody  50ug,100ug
  ★★  abs830030  GAPDH antibody  50ul,100ul
   abs132004  GAPDH antibody  50ug,100ug
   abs137959  GAPDH Mouse Monoclonal Antibody  50ug,100ug
   abs118936  GAPDH Polyclonal Antibody  50ul,100ul
   abs131993  Tubulin alpha Antibody  50ug,100ug
  ★★  abs830032  Tubulin Beta antibody  50ul,100ul
   abs131994  Tubulin beta Antibody  50ug,100ug
   abs125209  Tubulin Beta Polyclonal Antibody  50ul,100ul
二抗孵育  ★★  abs928  Goat anti-mouse IgG-HRP  100ul,500ul,1ml
  ★★  abs20002  Goat anti-rabbit IgG-HRP  100ul,500ul,1ml
  ★★  abs20003  Goat anti-Mouse IgG-FITC  1ml,500ul,100ul
  ★★  abs20004  Goat anti-Rabbit IgG-FITC  100ul,500ul,1ml
  ★★  abs20005  Rabbit anti-Goat IgG-HRP  100ul,500ul,1ml
一抗孵育   abs830001  Anti- GST  50ul,100ul
   abs830002  Anti- His Tag抗體  50ul,100ul
   abs830003  Anti- His(C-terminal Specific) 抗體  50ul,100ul
   abs830004  Anti- Myc 抗體  50ul,100ul
   abs830005  Anti- DYKDDDDK  50ul,100ul
   abs830006  Anti- HA 抗體  50ul,100ul
   abs830008  Anti-V5,mAb  50ul,100ul
   abs830010  Anti- GST,HRP  50ul
   abs830011  Anti- His Tag (HRP) 抗體  50ul
   abs830012  Anti- His(C-terminal Specific) (HRP) 抗體  50ul
   abs830013  Anti- Myc (HRP) 抗體  50ul
   abs830014  Anti- DYKDDDDK,HRP  50ul
   abs830015  Anti- HA (HRP) 抗體  50ul
   abs830016  Anti- V5 (HRP) 抗體  50ul
   abs137956  C-Myc-Tag Mouse Monoclonal Antibody  50ug,100ug
   abs137958  Flag-Tag Mouse Monoclonal Antibody  50ug,100ug
顯色  ★★★★★  abs920   ECL化學發光檢測試劑盒  2*25ml,2*50ml,2*250ml
   abs9212  DAB 顯色試劑盒(棕黃色,WB)  1kit
   abs9213  DAB 顯色試劑盒(紫藍色,WB)  1kit
其他輔助試劑   abs952  10*TBST  100ml,1L
   abs9152  Tween-20  500ml
  ★★  abs954  WB一抗二抗稀釋液  100ml
   abs969  Western一抗二抗去除液(中性)  250ml
   abs968  Western一抗二抗去除液(弱堿性)  250ml
   abs967  Western一抗二抗去除液(強堿性)  250ml
新手*  ★★★★★  abs926  WB solution base kit(rabbit)  1kit
  ★★★★★  abs927  WB solution base kit(mouse)  1kit
  ★★★★★  abs928  WB solution base kit(goat)  1kit

 

Absin特色產品線:
WB相關:ECL發光液、預染marker、預制膠;IHC相關:二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體;定制服務(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...
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